1樓：匿名使用者
以前反應產生的氣溶膠會成為副反應模板，必須出去，通常使用識別dutp的內切酶除去外來的模板。
注意模板的純度，通常dna，rna，甚至單個細胞都是可以作為模板的，但dna的純度可以達到很好，而rna次之，細胞的非特異性很多，建議使用dna模板。
酶需要用高保真和高速率的，推薦taq系列的，1kbp左右的速率，實驗室常用。
引物的設計，通常在20~30bp之間，退火溫度50℃~60℃，設計時保證引物的特異結合，減少非特異結合。
2樓：匿名使用者
所需的原料，酶等等，還有溫度。
pcr擴增過程
3樓：健康小馬甲
①首先是將含有待擴增dna樣品的反應混合物放置在高溫（>91℃）環境下加熱1分鐘，使雙鏈dna變性，形成單鏈模板dna；
降低反應溫度（約50℃）,致冷1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板dna發生退火作用並結合在靶dna區段兩端的互補序列位置上；
將反應混合物的溫度上公升到72左右保溫1-數分鐘，在dna聚合酶的作用下，從引物的3'-端加入脫氧核苷三磷酸，並沿著模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生dna互補鏈④重複以上操作。
pcr的基本要素和擴增原理是什麼？
4樓：匿名使用者
1．基本要素和擴增原理。
基本要素與dna複製的基本要素是一致的。待拷貝的 dna 稱為模板，它可以是雙鏈 dna 也可是單鏈dna，最後擴增得到的產物是雙鏈狀態的。引物是 dna 複製的先鋒，就象結晶過程中的晶核，引導 dna 的合成。
在 pcr 擴增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。dna 聚合酶是 dna 複製的動力，在 dntp 等底物存在時在引物的引導下沿著模板 dna 合成互補的 dna 鏈。
2．pcr 擴增的步驟。
首先將模板 dna 置於 92℃ -96℃，進行變性（denaturation）處理，使 dsdna 在高溫下解鏈成為 ssdna ，且熱變性不改變其化學性質；然後退火（annealing） ，將溫度降至 37℃ -72℃，使引物與模板的互補區相結合；最後，在 72℃ 條件下， dna 聚合酶將 dntp 連續加到引物的 3'-oh 端，合成 dna ，這個步驟稱為延伸（extension）。這三個熱反應過程的重複稱為乙個迴圈，經過 20-40 個迴圈可擴增得到大量位於兩條引物之間序列的 dna 片段。圖 5-1 所示是 pcr 反應前四輪示意圖。
如何提高擴增效率和pcr的特異性
5樓：匿名使用者
引物引物設計：引物長度適當，18-24mers，並保證序列獨特性，以降低序列在非目的片段中存在的可能性，但長度大於24核苷的引物並不意味著有更高的特異性，較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，反而降低特異性，而且長序列比短序列雜交慢，影響產量； 引物濃度：引物的濃度會影響特異性。
最佳的引物濃度一般在到。
較高的引物濃度會導致非特異性產物擴增。 -生物秀實驗頻道。
mg2+較高的mg2+濃度可以增加產量，但也會降低特異性。為了確定最佳濃度，從1mm到3mm，以遞增，進行最適mg2+濃度測定。
退火溫度。tm對於設定pcr退火溫度是必需的。退火溫度一般設定為比引物的tm低5℃的溫度。合理的退火溫度為55-70℃。
在理想狀態下，退火溫度應足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合 --生物秀實驗頻道。
巢式pcr使用巢式引物進行連續多輪擴增，由於同兩套引物都互補的靶序列很少，巢式pcr的使用降低了擴增多個靶位點的可能性，從而提高pcr反應的特異性和靈敏度。
遞減pcr通過在pcr的前幾個迴圈使用嚴謹的退火條件提高特異性。迴圈設在比估算的tm高大約5℃的退火溫度下開始，然後每個迴圈降低1℃到2℃，直到退火溫度低於tm 5℃。這樣，特異性最高的目的模板會被優先擴增，並在隨後的迴圈中繼續擴增佔據優勢。
熱啟動pcr
通過抑制一種基本成分延遲dna合成，直到pcr 儀達到變性溫度。最常用的是熱啟動dna 聚合酶，常溫時該酶活性被抑制，94-95℃加熱數分鐘後回覆正常活力開始反應，這樣可以避免起始迴圈溫度下的非特異性擴增，大大提高了pcr反應的靈敏度及特異性。熱啟動pcr是除了好的引物設計之外，提高pcr特異性最重要的方法之一。
pcr增強劑。
包括甲醯胺，dmso，甘油，甜菜鹼等，能構降低熔解溫度，從而有助於引物退火並輔助dna聚合酶延伸通過二級結構區。
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