1樓：小乖乖小鬧鬧
1. 請自行準備：無水乙醇、pbs及1.5ml離心管。
2. 取出析出液和洗滌液，按以下操作：
a) 析出液：4.5ml加入25.5ml無水乙醇；9ml加入51ml無水乙醇。
b) 洗滌液：9ml加入21ml無水乙醇；18ml加入42ml無水乙醇。
c) 配製好的析出液如出現沉澱，可在37℃溶解，搖勻後使用。
3. 細胞處理：a) 培養板培養的單層貼壁細胞，棄培養基，pbs清洗一遍，棄pbs；
b) 培養瓶培養的貼壁細胞應先用胰酶消化，處理為細胞懸液，細胞量在105-106為佳， 1,000 rpm 離心 5分鐘，徹底棄去上清，加入100μl pbs振盪至細胞懸浮；
c) 培養的細胞為懸浮細胞，1,000 rpm 離心 5分鐘，徹底棄去上清，加入100μl pbs振盪至細胞懸浮。
4. 加入200μl裂解液，20μl消化液a，振盪混勻，室溫放置5分鐘。
5. 加入20 μl 消化液b，充分振盪混勻，56℃水浴10 分鐘至細胞完全裂解。
6. 加入500μl析出液，輕輕顛倒混勻，如有半透明懸浮物，不影響dna的提取與後續實驗。
7. 將吸附柱放入收集管內，將上述溶液轉入吸附柱內，靜置2 分鐘，12,000 rpm 4℃離心1 分鐘，棄收集管內廢液。
8. 將吸附柱放**集管內，加500μl 洗滌液至吸附柱內，12,000 rpm 4℃離心1 分鐘，棄收集管內廢液。
9. 將吸附柱放**集管內，12,000 rpm 4℃離心2 分鐘，離去殘留的洗滌液。
10. 取出吸附柱，放入新的1.5 ml 離心管內，加入50-200 μl 洗脫液，靜置3分鐘，12,000 rpm 4℃ 離心2分鐘，收集dna溶液。
提取的dna即可用於下一步實驗或-20℃儲存。
此方法應該配上biog的試劑盒，目前我們實驗室一直這樣做的
dna粗提取實驗步驟？
2樓：孫福學
一 教學目的
1.初步掌握dna的粗提取和鑑定的方法。
2.觀察提取出來的dna物質。
二 教學建議
在本實驗的教學中，教師應注意以下幾點。
1.實驗材料必須準備充足。本實驗所用的實驗材料是雞血細胞液,由活雞的鮮血經沉澱後獲得。
每組(2個學生)需用5 ml 雞血細胞液,則每班(50人)至少需要130 ml,而雞血細胞液與雞血的體積比為1:3,這樣每班至少需要390 ml 雞血細胞液。宰殺1只中等大小的活雞,一般可得120 ml 左右的鮮血,因此,1個班實驗需要買4只活雞。
如果不具備購買活雞的條件,也可以到市場售活雞處去索取雞血,但所帶燒杯中必須提前放入抗凝劑。
2.盛放雞血細胞液的容器,最好是塑料容器。雞血細胞破碎以後釋放出的dna,容易被玻璃容器吸附,由於細胞內dna的含量本來就比較少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的dna就會更少。
因此,實驗過程中最好使用塑料的燒杯和試管,這樣可以減少提取過程中dna的損失。
3.獲取較純淨的dna的關鍵步驟。
(1)充分攪拌雞血細胞液dna存在於雞血細胞的細胞核中。將雞血細胞液與蒸餾水混合以後,必須用玻璃棒沿乙個方向快速攪拌,使雞血細胞加速破裂,並釋放出dna。
(2)沉澱dna時必須用冷酒精實驗前必須準備好大量的體積分數為95%的酒精,並在冰箱(至少5s以下)中至少存放24 h。
(3)正確攪拌含有懸浮物的溶液實驗步驟3、5、7,都需要用玻璃棒攪拌。教師應提醒學生注意,在進行步驟3、5時,玻璃棒不要直插燒杯底部,而且攪拌要輕緩,以便獲得較完整的dna分子。進行步驟7時,要將玻璃棒插入燒杯中溶液的中間,用手緩慢轉動510 min。
三 參考資料
實驗原理的補充介紹
1.dna的釋放 dna位於雞血細胞的細胞核中,正常情況下不會釋放出來。為了使dna從細胞核中釋放出來,實驗中採用了向雞血細胞液中加入蒸餾水並且攪拌的方法。
蒸餾水對於雞血細胞來說,是一種低滲液體,水分可以大量進入血細胞內,使血細胞破裂。同時,再加上攪拌的機械作用,就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂),於是釋放出dna,當然也有rna。但是,釋放出來的大量dna和rna往往與蛋白質結合在一起。
2.將dna與蛋白質分離 根據二者的特性,即在濃度較高的氯化鈉溶液(物質的量濃度為2 mol/l )中,核蛋白容易解聚,游離出dna。而dna在濃度較高的氯化鈉溶液中的溶解度很高,na+與帶負電的dna結合成dna鈉鹽。
這時dna在溶液中呈溶解狀態。
3.dna的析出與獲取 利用dna在濃度較低的氯化鈉溶液中溶解度小的原理,向含有dna的濃度較高的氯化鈉溶液中加入大量(300 ml )蒸餾水,稀釋氯化鈉溶液,使dna的溶解度下降,而蛋白質的溶解度增高(這就是蛋白質的鹽溶現象),從而使二者分離。這時,加上不停地攪拌,溶解度下降的dna逐漸呈絲狀物。
再通過過濾,濾去蛋白質,就可以獲取dna的黏稠物了。如果採用離心法則更好,用4 000 r/min 的旋轉頻率,離心15 min ,除去上清液(含有蛋白質),留下的沉澱物中含dna。
4.dna的再溶解 再用較高濃度的氯化鈉溶液去溶解dna黏稠物。
5.dna的沉澱和濃縮 除去了蛋白質的核酸溶液,必須再進一步沉澱和濃縮。最常用的方法是酒精沉澱法。
就是將含有na+的dna溶液,加入到相當於其兩倍體積的體積分數為95%冷酒精溶液中,混勻以後可以使dna沉澱、濃縮,形成含雜質較少的dna絲狀物,懸浮於溶液中。如果出現的絲狀物較少,可以將此混合液再放入冰箱中冷卻幾分。濃縮後的dna絲狀物,可以用緩緩旋轉玻璃棒的方法捲起(因為玻璃棒有吸附dna的作用)。
6.dna的鑑定 本實驗中鑑定dna的方法為二苯胺法(配方見下述的「藥品配製」)。二苯胺法的原理是:
dna中嘌呤核苷酸上的脫氧核醣遇酸生成ω-羥基-γ酮基戊醛,它再和二苯胺作用而顯現藍色(溶液呈淺藍色)。
鑑定時溶液藍色的深淺,與溶液中dna含量的多少有關。
二苯胺試劑的配製
a液： 15 g二苯胺溶於100 ml 冰醋酸中,再加15 ml濃硫酸,用棕色瓶儲存。如冰醋酸呈結晶狀態,則需加溫後待其熔化,再使用。
b液： 乙醛的體積分數為0.2%的溶液。
配製： 將0.1 ml b液加入到10 ml a液中,現配現用。
dna粗提取與鑑定的另一種方法
1.材料用具
新鮮菜花(或蒜黃、菠菜)。
塑料燒杯,量筒,玻璃棒,尼龍紗布,陶瓷研缽,試管,試管架,試管夾,漏斗,酒精燈,石棉網,三角架,火柴,刀片,天平。
研磨液,體積分數為95%的酒精溶液,二苯胺試劑,蒸餾水。
2.方法步驟
(1)dna的粗提取
①準備材料 將新鮮菜花和體積分數為95%的酒精溶液放入冰箱冷凍室,至少24 h。
②取材 稱取30 g菜花,去梗取花,切碎。
③研磨 將碎菜花放入研缽中,倒入10 ml研磨液,充分研磨10 min 。
④過濾 在漏斗中墊上尼龍紗布,將菜花研磨液濾入燒杯中(有條件的學校可將濾液倒入塑料離心管中進行離心,用1 000r/min的旋轉頻率,離心25 min,取上清液放入燒杯中)。在4 ℃冰箱中放置幾分後,再取上清液。
⑤加冷酒精 將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分數為95%的冷酒精溶液中,並用玻璃棒緩緩地輕輕攪拌溶液(玻璃棒不要直插燒杯底部)。沉澱35 min後,可見白色的dna絮狀物出現。用玻璃棒緩緩旋轉,絮狀物會纏在玻璃棒上。
(2)dna的鑑定
①配製二苯胺試劑 取0.1 ml b液,滴入到10 ml a液中,混勻。
②鑑定 取4 ml dna提取液放入試管中,加入4 ml 二苯胺試劑,混勻後觀察溶液顏色(不變藍)。用沸水浴(100 ℃)加熱10 min 。在加熱過程中,隨時注意試管中溶液顏色的變化(逐漸出現淺藍色)。
研磨液的配製方法
tris：10.1 g(相對分子質量為121.14),先加50 ml 蒸餾水溶解,用物質的量濃度為2 mol/l 的鹽酸調至ph8.0,再加下述藥品。
nacl：8.76 g(相對分子質量58.44)
edta：37.2 g(相對分子質量372.24)
sds：20 g(相對分子質量288.3)
待上述藥品全部溶解後,再用蒸餾水定容至1 000 ml。
若在室溫低於20 ℃時配製藥液,sds呈沉澱析出,此時需要加溫,才能將sds溶解。如果提前配製的研磨液出現了沉澱,則應加溫使沉澱溶解後再使用。
研磨液中幾種藥品的作用
sds(十二烷基磺酸鈉):可使蛋白質變性,與dna分離。
edta(乙二胺四乙酸二鈉):為dna酶的抑制劑,可以防止細胞破碎後dna酶降解dna。
物質的量濃度為0.15 mol/l的氯化鈉溶液：能很好地溶解dna。
tris/hcl：提供緩衝體系,dna在這個緩衝體系中呈穩定狀態。(tris為三羥甲基氨基甲烷)
鑑定dna的其他方法 用紫外燈照射法鑑定dna效果很好。具體鑑定方法如下。
1.配製染色劑。用蒸餾水配製萬分之五的溴化乙錠(eb)溶液。
2.將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹於蠟紙上,再滴1滴eb溶液染色。
3.將蠟紙放在紫外燈(260 nm)下照射(暗室中),可見橙紅色的螢光(dna的紫外吸收高峰在280 nm處)。
3樓：教育科學站
實驗21dna的粗提取
4樓：飛雪之靈
dna提取的步驟及原理
5樓：匿名使用者
酚-氯仿法提取人外周血基因組dna的基本原理是什麼？
答：蛋白質對dna製品的汙染常常影響到以後的dna操作過程，因此需要把蛋白質除去。一般採用苯酚/氯仿抽提的方法。
苯酚、氯仿對蛋白質有極強的變性作用，而對dna無影響。經苯酚/氯仿抽提後，蛋白質變性而被離心沉降到酚相與水相的介面，dna則留在水相。
取acd抗凝血2~3ml，置於15ml的離心管內----加滅菌生理鹽水至10ml，顛倒混勻，3000rpm，離心10min-----棄上清，重複步驟2兩至三次，直至上清呈無色或微紅色----加壓積紅細胞5.5倍的溶血試劑，混勻，放置-20℃冷溶10min後移至4℃，30min，直至溶液由紅色懸液變成紅棕色清亮溶液-----3000rpm，離心15min，倒扣離心管於濾紙，使管壁液體流盡-----依次加入ste 450 ml，用槍頭吹打混勻後，加入蛋白酶k至終濃度100mg/ml，然後加入10% sds 25 ml，混勻後移至1.5ml ep管，放置於37℃水浴過夜或56℃，3h----加入等體積飽和酚（約500ml），漩渦振盪器上混勻至溶液呈乳滴狀，13000rpm，離心5min。
------取上清，加入500μl酚/氯仿（等體積配製混合液），漩渦振盪混勻，13000rpm，離心10min。---------取上清，加入500μl氯仿/異戊醇（24：1混合），漩渦振盪混勻，13000rpm，離心10min。
-------取上清，加入50μl物naac（1/10體積），混勻後再加入1ml 冰凍的無水乙醇，顛倒輕搖，即可見絮狀的dna沉澱，13000rpm，離心10~20秒，得到dna沉澱。------------dna沉澱用70%乙醇洗2~3遍。--------待乙醇揮發後，dna沉澱用100μl te緩衝液溶解，核酸蛋白測定儀分析dna濃度和純度，-20℃儲存備用。
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高中生物裡邊用的方法。原理 dna在nacl溶液中的溶解度，是隨著nacl的濃度的變化而改變的。當nacl的物質的量濃度為。mol l時，dna的溶解度最低。利用這一原理，可以使溶解在nacl溶液中的dna析出。不溶於酒精溶液，但是細胞中的某些物質則可以溶於酒精溶液。利用這一原理，可以進一步提取出含...
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